直線TTX assay protocol

041008 by Hiroko ITO

装置・材料

　直線温度勾配装置

　扇風機２つ、空調

TTXプレート：栄研２号角シャーレ（14/10/1.45cmH）に通常のTTXプレート用寒天を18mlずつまく。

アルミ板（14/10/0.1cm）

　エサをまいたNGM寒天培地プレート（直径６cm）：NGMプレート

S Basal Buffer

　dH₂O

15mlプラスチック製試験管

　ピペットマン（1000ul, 20ul）

　チップ 110黄：先を、内径1.5mmとなるように切り取っておく。

　パスツールピペット

　クロロホルム

廃液入れ：上清を捨てるため。アッセイ後は、オートクレーブしてから捨てる。

全体的な注意点

空調の風向きは、直線温度勾配装置上のプレートに直接あたらないように調節する。

アッセイ用の線虫は小さなインキュベータで育てる。

洗浄の操作は、できるだけ速やかに行う。

個体をプレートにのせた後、水分を残さない。

操作

　１　アッセイの４〜５日前に、NGMプレートにL4幼虫を１個体ピックする*1。

　２　S Basal BufferとdH₂Oは、前日から20℃インキュベータに入れて20℃にしておく。

　３　アッセイの12時間前に、直線温度勾配装置の恒温槽のスイッチをつける。空調は25℃にし、扇風機で空気をかきまぜておく。

　４　アッセイ開始までに、TTXプレートの表面を、室温で30分間、乾燥させる（ドラフトは使わない）。

　５　乾燥させたTTXプレートの裏に、油性ペンで、プレート全体を８等分するように（1.75cm間隔で）直線を引く。低温側（L）、高温側（H）を記入し、日付、（アッセイする台の）左か右かの区別、および株名をプレートの隅に記入する。さらに、中央線に沿って３カ所、線虫を置く位置の印を付けておく。各ラインとも、アッセイ用TTXプレート（温度勾配あり）と、そのControl用TTXプレート（温度勾配なし）を用意する。

　６　直線温度勾配装置のアルミ台の表面温度を、左右の台とも、それぞれ低温側から25cmと30cmの２カ所について測定する。また、アルミ台の表面温度が20℃である位置を確認しておく。

　７　直線温度勾配装置にアルミ板をおき、水道水を約10mlたらしてから、TTXプレートをおく*2。プレートからはみでた水は拭きとる。アルミ台の表面温度が20℃である位置をTTXプレートの中心線と一致させる。１つのアルミ台につき２枚アッセイできる。

　８　young adultかadultが多いNGMプレートを使用する。卵はたくさん産まれていてもよいがL1幼虫が孵化していないこと。

　以下の操作は、すべて20℃の水槽中で行う*3。

　９　15〜20枚のNGMプレートに1mlずつS Basal Bufferを加えて、線虫を浮かせる。パスツールピペットで15mlプラスチック試験管に線虫を回収する。

　10　約１分後、線虫が沈んだら、上清を取り除き*4、2 ml S Basal Bufferで１回洗浄する。

　11　5 ml dH₂Oで１回すすぎ、20ulほど残して上清を除く。

　12　先を直径1.5mmに切ったチップを用いて、直線温度勾配装置上のTTXプレートに、線虫を１カ所につき5ulとり、3カ所のせる。個体数は100 〜300 worms / TTX plateとする。寒天の表面を傷つけないように温度勾配のないControl用TTXプレートにも、同様に３カ所のせる。余分な水はソフトティッシュで吸い取る。

　13　水分が完全になくなり、拡散し始めたのを確認してから60分間、静置する。

　14　TTXプレートを裏返し、ふたにクロロホルムを5ml加え、線虫を殺す。

15 それぞれの区画にいた線虫の個体数をかぞえ*5、TTX indexを算出する。

TTX index = {(-4)・N₁+ (-3)・N₂+ (-2)・N₃+ (-1)・N₄

+ (+1)・N₅+ (+2)・N₆+ (+3)・N₇+ (+4)・N₈} / N_Total

N_n：区画nにいた線虫の個体数（n = 1〜8）

N_Total：プレートにいた線虫の総個体数

注意点

*1　NGMには2個体以上のせない。２個体以上のせると23℃飼育ではうまくいかない。

*2　プレートとアルミ板の中の空間を埋めないと、正確な温度勾配が形成されない。

*3　洗浄中に飢餓がかかるのを防ぐため。

*4　約１分待って個体が底に沈みきらないときは、その個体ごと上清を取り除く。

*5 個体の成長段階にばらつきがあるときは、adultの個体のみをカウントする。